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题目：miR-515-3p及其靶点波形蛋白和MMP3作为食管癌转移的关键调控机制的研究：功能和临床意义
出自：信号传导与靶向治疗杂志
影响因子：17.21
肿瘤转移是恶性肿瘤的重要标志之一，也是癌症患者治疗失败的主要因素，但其机制尚待阐明，迫切需要新的有效治疗策略。
肿瘤转移通常涉及到上皮细胞间质转型（EMT），即具有极性的上皮细胞转换成为具有活动能力的间质细胞并获得侵袭和迁移能力的过程,这个过程常伴随着上皮细胞表达下调和间质细胞表达上调。而波形蛋白是EMT最常用的标志物之一，并且，大量研究已经表明，波形蛋白与肿瘤转移密切相关（癌症转移过程中一般高表达）。 此外，肿瘤的转移也少不了酶的参与。基质金属蛋白酶（MMP）如MMP-1、2、3、6、9等成员被认为是主要的蛋白水解酶，可水解基质成分，破坏组织屏障，促进肿瘤转移。其中MMP3不仅降解细胞外基质和基底膜，也可激活多种基质金属酶前体，为肿瘤进展过程中的组织侵袭和转移提供条件。 MicroRNAs（miRNAs）是高度保守的非编码RNA产物，由约22个核苷酸组成，以单链形式存在。miRNAs可通过与靶基因CDS序列（基因编码区）或3’-UTRs序列（非编码区）结合导致特定靶基因的降解（目前对于miRNA作用于靶基因的原理大多都是这么认为），从而抑制基因表达。 人类基因组中超过60%的基因都受miRNAs调控，它们参与着大多数包括癌症在内的各种疾病的生理和病理过程，但是关于功能性miRNAs在食管癌转移中的报道很少。越来越多的研究表明，miRNAs在调节恶性细胞增殖方面具有重要作用，非常有潜力作为有效的癌症诊断因子。 然而，侵袭和转移的关键驱动因素的潜在调控机制，以及miRNA在食管鳞状细胞癌（ESCC）转移中的功能和临床意义仍有待进一步探讨。 作者通过比较高侵袭性和转移性ESCC细胞亚系（一系列体外和体内筛选建立）与亲本细胞的miRNA谱，找到了几个在高转移性ESCC细胞中差异表达最显著的miRNA。在这些候选miRNA中，miR-515-3p在高侵袭性和转移性亚系中的表达被证实是下调的，并且与肿瘤的转移相关。 于是，作者通过一系列的功能获得和丧失实验以及体内和体外功能实验（Boyden小室细胞侵袭实验、伤口愈合实验、细胞黏附实验等），来研究miR-515-3p对肿瘤侵袭和转移的影响以及潜在的上下游机制。并且评估miR-515-3p在治疗癌症转移中的治疗潜力。
3.1 解除miR-515-3p的调控与食管癌患者的生存率相关 作者通过高转移性ESCC亚系KYSE150-Luc-LM3的miRNAs谱与KYSE150-Luc亲本细胞进行比较，在KYSE150-Luc-LM3细胞中前50个下调的miRNAs中，选择了6个miRNAs，以检测它们对癌细胞侵袭行为的影响，目前并没有关于这些miRNAs参与肿瘤转移的报道。 结果显示miR-515-3p过表达明显抑制KYSE150-Luc-LM3细胞的侵袭（图1a，b）,因此成成为了作者的研究重点。与正常上皮细胞(与癌细胞相邻的组织中获得)相比，食管鳞癌细胞中miR-515-3p的表达较低（图1c）。作者还通过一系列体外筛选建立了高侵袭性亚系KYSE410-Luc-I6，并发现在高侵袭性和转移性亚系：KYSE410-Luc-I6和KYSE150-Luc-LM3中miR-515-3p表达进一步降低（图1d）。
为了评估miR-515-3p在食管鳞癌中的临床意义，作者取了100例原发性食管鳞癌组织和70例与之相邻的正常组织，通过原位杂交分析miR-515-3p的表达（图e）。大多数肿瘤组织的miR-515-3p染色弱于正常组织（图f）。如图g所示，45.7%（32/70）的正常组织中的miR-515-3p高表达，而肿瘤组织中miR-515-3p的高表达率只有22.0%（22/100）。值得注意的是，低表达miR-515-3p的患者的生存期（中位生存期=22.4个月）明显短于高表达miR-515-3p的患者（中位生存期=57.0个月）（图h）。
根据OncomiR癌症数据库的数据分析结果，miR-515-3p的表达与食管癌患者的生存率显著相关，这说明miR-515-3p可能是一种新的肿瘤诊断和预后的生物标志物。3.2 miR-515-3p在ESCC细胞系和组织中被启动子高甲基化沉默 为了研究miR-515-3p在ESCC中的表达下调是否是由于启动子高甲基化所致，作者使用5-氮杂-2-脱氧胞苷（5-Aza）处理ESCC细胞（它通过使DNA去甲基化来治疗ESCC）。结果表明，与对照组相比（即没有经过5-Aza处理），实验组的miR-515-3p表达显著增加，且处理浓度越大，miR-515-3p的表达越高（图a）；全基因组甲基化测序表明，在miR-515-3p的启动子区域中5’CpG区重度甲基化（图b）；值得注意的是，甲基化特异性PCR验证结果显示，miR-515-3p内的CpG区显著的高度甲基化，但在正常食管上皮细胞中没有（图c）。 图d是食管鳞癌细胞系的侵袭力结果，结果显示miR-515-3p甲基化水平与食管鳞癌细胞系的侵袭能力显著正相关（r=0.82，p<0.05）。 作者还测定了28对ESCC肿瘤和正常组织中miR-515-3p的甲基化水平和表达水平（图e，f）。与正常组织相比，60.7%（17/28）的食管鳞癌组织中miR-515-3p显著高甲基化（图e），64.3%（18/28）的食管鳞癌肿瘤组织中miRNA-515-3p的表达低于相邻正常组织（图f）。并且，在28对ESCC组织和正常组织中，miR-515-3p的表达与其甲基化水平呈负相关（r=− 0.46，p<0.05（图g））。 这些数据表明，启动子甲基化导致食管鳞癌中miR-515-3p表达失调。 miR-515-3p在ESCC侵袭转移中的作用尚未见报道，因此，作者首先探索了miR-515-3p的过表达对高度侵袭性和转移性ESCC细胞KYSE410-Luc-I6和KYSE150-Luc-LM3的影响。结果表明，与对照组相比，KYSE410-Luc-I6-miR-515-3p和KYSE150-Luc-LM3-miR-515-3p细胞具有较低的侵袭、迁移和粘附能力（图b）；另一方面，敲除miR-515-3p增加了ESCC细胞的侵袭、迁移和粘附能力（图e）。 此外，我们的结果显示，miR-515-3p在24小时内没有对ESCC细胞的增殖和凋亡产生任何变化，消除了miR-515-3p过度表达会对增殖和凋亡的影响的可能性。3.4 miR-515-3p直接靶向并抑制波形蛋白和MMP3的表达 为了探索miR-515-3p调控的分子机制，首先，作者通过RNA测序发现173个下调基因（倍数变化>1.5）（图a，b）。同时，利用miRNA靶基因预测软件（miRanda）预测miR-515-3p的潜在靶点，并与测序结果取交集，发现有五个基因可能为miR-515-3p的潜在靶点。 Computational分析表明miR-515-3p可能的结合位点分别位于波形蛋白的编码序列（CDS）和MMP3的3′-UTR序列（图b），这一猜想通过荧光素酶分析和western blot得到了证实。 此外，获得和丧失功能实验和western印迹分析表明，瞬时转染miR-515-3p或miR-515-3p质粒在mRNA和蛋白质水平上显著降低波形蛋白和MMP3的表达，而用抑制剂沉默miR-515-3p对波形蛋白、MMP3和EMT marker有相反的影响（图h，i）。 以上数据都表明，miR-515-3p通过结合波形蛋白的CDS区域和MMP3的3′-UTR区域影响其表达水平，这给了我们启发：miR-515-3p的下调可能导致波形蛋白和MMP3介导的肿瘤侵袭和转移。3.5 波形蛋白和MMP3介导miR-515-3p对肿瘤的作用 接下来作者研究了波形蛋白和MMP3以及miR-515-3p在肿瘤转移中的协同作用。他将miR-515-3p、MMP3、波形蛋白作为实验组中的变量，比较EMT marker的表达水平及其侵袭和迁移能力。在miR-515-3p过度表达的细胞中观察到纤维连接蛋白和N-钙粘蛋白表达降低以及E-钙粘蛋白和ZO-1表达增加，并且这些效应被波形蛋白组、MMP3组或波形蛋白和MMP3组的表达所消除（图a）。
另一方面，体内试验结果表明：miR-515-3p对ESCC细胞的侵袭和迁移有明显的抑制作用，而波形蛋白和MMP3的过度表达则明显恢复了ESCC细胞的侵袭和迁移能力（图b）。 相反，波形蛋白和MMP3在大鼠脑组织中的表达也不同。miR-515-3p-knockdown-ESCC细胞系（KYSE150-Luc-ZIP-miR-515-3p，EC109-ZIP-miR-515-3p）被shRNA进一步抑制（图c）。波形蛋白或MMP3的敲除显著消除了miR-515-3p敲除对ESCC细胞侵袭、迁移和EMT marker表达的影响。 总之，这说明了miR-515-3p通过直接靶向波形蛋白和MMP3抑制肿瘤侵袭和转移。3.6 miR-515-3p的全身给药抑制肿瘤转移 鉴于miR-515-3p在ESCC转移中发挥着重要作用，所以我们有必要评估miR-515-3p治疗转移性ESCC的临床意义。转染实验结果表明，转染miR-515-3p寡核苷酸的细胞与对照组相比具有更低的侵袭、迁移和粘附能力（图a，b），并且在转染miR-515-3p寡核苷酸的细胞中观察到纤维连接蛋白和N-钙粘蛋白表达减少以及E-钙粘蛋白和ZO-1表达增加（图c）。 除了转染实验，作者还建立了ESCC模型鼠，将miR-515-3p或miR-CON通过静脉注射的方式注射到小鼠体内，观察9周。结果显示，与用miR-CON组相比，注射miR-515-3p寡核苷酸显著抑制小鼠的癌细胞转移（图c），表明miR-515-3p可能是治疗转移癌的潜在治疗因素。 作者通过RNA测序和靶基因预测，发现了6个候选miRNAs可能参与肿瘤转移，其中 miR-515-3p在肿瘤中的差异表达最显著。且miR-515-3p的调控解除与细胞侵袭和转移在功能上相关，作者首次证实miR-515-3p通过直接与波形蛋白和MMP3结合，显著抑制ESCC细胞的侵袭和转移，在研究miRNA在ESCC转移中的作用机制和功能上具有重要意义。 此外，作者验证了miR-515-3p过表达细胞联合过表达波形蛋白和MMP3（miR-515-3p-vimintin-MMP3）与miR-515-3p过表达细胞单独过表达波形蛋白(miR-515-3p-vimintin-CON)或MMP3（miR-515-3p-CON-MMP3）相比具有更高的侵袭和迁移能力，并且几乎完全恢复了miR-515-3p对ESCC侵袭和迁移的抑制作用。虽然我们并不清楚波形蛋白和MMP3是否相互调节，但两者在介导miR-515-3p在ESCC细胞侵袭和转移中的作用方面具有明显的相加作用。 更进一步的，作者利用体外和体内实验证明，miR-515-3p分别直接结合到波形蛋白和MMP3的CDS和3′-UTR区域，抑制ESCC的侵袭和转移。这些发现说明miR-515-3p是EMT抑制肿瘤转移的新调节因子，这为ESCC治疗提供了一个有用的治疗策略。
恶液质与肿瘤转移 | 免疫学专题
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